Metode și tehnici de crioconservare a embrionilor la animale: vitrificare, congelare lentă și aplicații practice

Congelarea definește procesul de transformare a produsului dintr-o fază lichidă în faza solidă cu pierdere de căldură. În acest proces se pot forma cristale de gheață. Vitrificarea reprezintă procesul de solidificare din stare lichidă într-o stare foarte asemănătoare sticlei, fără formare de cristale de gheață. - congelarea treptată - temperatura coboară și apa cristalizează în afara celulei. - vitrificarea - soluția este răcită rapid, ceea ce previne formarea cristalelor de gheață. Scopul crioprotectorului este de a minimiza leziunile pe perioada congelării și decongelării. În plus se adaugă o sursă de proteine - un ser sintetic pentru a stabiliza membranele. Concentrația ridicată de crioprotectant poate fi toxică, unii crioprotectanți fiind mai toxici (propilenglicol).

Tipuri de crioprotectanți și importanța lor

• Crioprotectanți permeabili - au greutatea moleculară mică și traversează repede membrana bazală, înlocuind apa de la nivel intracelular.
• Crioprotectanți non-permeabili - se leagă de membrană și generează astfel un mediu extracelular hiperosmotic.

În timpul decongelării, îndepărtarea rapidă a crioprotectantului determină un influx rapid de apă intracelular, ceea ce poate duce la ruperea celulei. Pe durata conservării, celulele sunt ținute la o temperatură foarte scăzută unde orice activitate metabolică încetează. În procesul de răcire cristalele de gheață formate în celulă determină un dezechilibru osmotic între mediul intra și extracelular. Cel mai comun crioprotectant pentru spermă este glicerolul (agent permeabil). Acesta poate fi folosit singur sau cu agent buffer. Specimene oligozoospermice nu se spală înaintea crioprezervării. Crioprezervantul se adaugă picatură cu picătură pentru a evita șocul osmotic.

Proceduri de congelare și pregătire pentru crioconservare

Poate fi făcută la temperatura camerei sau criotubul poate fi ținut în mână 5-10 minute, sau plasat în apă la 37 grade. Dacă se îndepărtează crioprezervantul, se adaugă mediu de cultură încet, apoi se centrifughează și sunt suspendate în mediu fresh. Stocarea în vapori reduce cross contaminarea. Probele se țin în loc închis cu alarmă, cu ventilație corespunzătoare și senzor de oxigen. Deoarece zona pelucida la embrion și ovocite este poroasă și este susceptibilă la crosscontaminare cu agenți infecțioși, azotul lichid poate acumula agenți microbieni. În stadiul pronuclear este crucial a se evita congelarea în perioada ciclului celular când pronucleii încep să migreze în singamie, cu sinteza ADN și formarea fusului de diviziune, când microtubulii sunt foarte sensibili la schimbările de temperatură.

Protocolul de încălzire și etape de dezgheț

Protocolul de încălzire - se ține proba cam 40 de secunde la temperatura camerei, apoi se introduce în baie de apă la 40 grade, pentru câteva minute. Se îndepărtează crioprotectantul prin amestec cu soluție de sucroză, apoi urmează spălarea de 3 ori în mediu de spălare. Exemplu protocol blastocist: Embrionul se pipetează în soluție izotonică, pe rând în cele 3 soluții de vitrificare V1, V2, V3, iar apoi în nitrogenul lichid. În cazul congelării blastocistului există riscul de colapsare a blastocilului după încălzire.

Strategii de crioconservare în fertilizarea în vitro

Adesea, în urma unei proceduri de fertilizare in vitro, numărul de embrioni obținuți depășește numărul celor care vor fi transferați în uter. Embrionii suplimentari pot fi congelați în ziua 5-6 și păstrați pentru proceduri viitoare. În acest fel, în cazul în care transferul de embrioni fresh nu se finalizează cu o sarcină, cuplul poate încerca din nou, recurgând la embriotransfer cu embrioni congelați. Chiar dacă pare o procedură simplă, congelarea embrionilor este un proces foarte complex. Embrionii pot fi congelați imediat după fertilizare (înghețarea în faza de pronucleu - în stadiile incipiente ale dezvoltării) sau atunci când se află în etapele ulterioare de dezvoltare (înghețarea în faza de blastocist).

Temperaturi, vitrificare și rezultate

Această tehnică presupune reducerea treptată a temperaturii embrionilor, până când ajung la temperatura de păstrare, care este de -196 de grade Celsius. Unul dintre pericolele înghețării lente a embrionilor este formarea cristalelor de gheață. Pentru a scădea riscul formării cristalelor de gheață, înainte ca embrionul să fie congelat este îmbibat într-o soluție numită “crioprotector”, care protejează țesutul biologic de efectele dezghețului. Dezghețarea embrionilor se efectuează printr-o metodă rapidă. Rata de supraviețuire a embrionilor congelați rapid este de aproximativ 95%, similară cu a embrionilor proaspeți. Pentru a pregăti un embrion pentru înghețare rapidă, concentrația de crioprotector este mai mare decât cea utilizată pentru înghețarea lentă. Procesul este realizat în timp ce celulele embrionului sunt la temperatura camerei.

Vitrificarea ca metodă dominantă în crioconservare animală

Vitrificarea este o tehnică de crioprezervare a gametilor și a embrionilor, care evoluează rapid. Definiția vitrificării este: “solidificare într-o stare de viscozitate extremă în procesul de înghețare fără a forma cristale de gheață”. Congelarea embrionilor este un proces prin care embrionii formați în laborator sunt congelați prin vitrificare și depozitați pentru utilizare ulterioară. Scopul tratamentului FIV este de a crea mai mulți embrioni sănătoși într-un ciclu de tratament care sunt potriviți pentru transferul embrionilor. La clinica noastră, îți recomandăm să transferi 1 sau, rar, cel mult 2 embrioni într-un ciclu. Congelarea embrionilor este esențială pentru cuplurile care au nevoie de teste genetice pentru a asigura sănătatea viitorului lor copil. În aceste cazuri, embrionii creați prin FIV sunt congelați prin vitrificare după ce au fost supuși testării genetice preimplantare (PGT). Embrionii sănătoși rămași pot fi depozitați pentru utilizare ulterioară.

Compararea metodelor: avantaje, limitări și decizii clinice

Studiile sugerează că, dacă se compară embrionii proaspeți cu cei congelați, embrionii congelați pot avea, de fapt, un rezultat mai bun al sarcinii, împreună cu o șansă mai mică de complicații obstetricale precum travaliul prematur și restricția de creștere fetală. Vitrificarea necesită concentrații mari de crioprotectanți pentru a deshidrata celulele și a preveni formarea cristalelor; în același timp, toxicitatea CPAs poate fi limitatoare, în special pentru spermă. Pentru ovule și embrioni, tehnica vitrificării a permis îmbunătățiri semnificative ale ratei de supraviețuire și ale ratelor de implantare în multe specii. Pe durata programelor de reproducere la animale, tehnicile au evoluat de la congelare lentă la vitrificare, crescând stabilitatea materialelor crioprotectoare, eficiența și siguranța procesului.

Istorie și context practic

Crioprezervarea își are rădăcinile în anii 1940: congelarea spermatozoizilor a fost aplicată inițial în medicina veterinară. Congelarea și conservarea la minus 196 °C a ovulelor fecundate s-a dovedit a fi o sarcină mult mai grea. Primul succes major a fost raportat în anii '80, iar în 1984 un grup din Rotterdam a înregistrat rezultate semnificative. În zilele noastre crioprezervarea a devenit o procedură de rutină, cu legi și protocoale standard în terapiile de reproducere asistată. Vitrificarea, ca metodă de crioprezervare, evoluează rapid și este preferată pentru majoritatea gametilor și embrionilor în multe centre de fertilitate veterinare.

Observații practice despre diferențe între specii

Rata de supraviețuire după vitrificare variază în funcție de specii, stadiul celular și condițiile de laborator. Pentru ovule, o problemă majoră esteSensitivity la stres osmotic și la toxicitatea CPAs. Pentru embrioni, vitrificarea este în general bine tolerată, deși pot apărea dificultăți precum colapsul blastocistului după dezgheț. În general, pentru ovule și embrioni, vitrificarea este considerată superioară conservării lente datorită ratei de supraviețuire mai mari și a reducerii formării cristalelor de gheață.

Concluzii operaționale pentru practică în ferma de animale

În zilele noastre, metoda recomandată și cea mai utilizată în secțiile veterinaro-științifice este vitrificarea pentru gamete și embrioni. Supravegherea atentă a ciclului ovarian, momentul potrivit pentru colectare, testele genetice preimplantare (PGT) când este cazul, precum și alegerea corectă a protocoalelor de vitrificare sunt factori-cheie ai succesului. Dacă se fertilizează mai mult de trei ovule, există posibilitatea congelării celor aflate în plus pentru utilizări viitoare. Capacitatea de a conserva embrioni și ovule oferă o flexibilitate clinică semnificativă, inclusiv posibilitatea de a amâna deciziile de transfer până la momentul potrivit pentru pacientă și cuplu.

tags: #crioconservarii #embrionilor #la #diferite #animale

Postări populare:

• Endometrul: dimensiuni, semnificații în fertilizarea asistată
• Beneficiile și riscurile consumului de grapefruit în sarcină
• Crețisoara și fertilitatea: ce spun studiile despre beneficii
• Ghid detaliat: cum se dezvoltă bebelușul în primele 12 luni, pe luni
• Simptomele tăieturii în zona scutecului la bebeluși de 9 luni