Se inoculează 0,1-0,2 ml din supernatantul clarificat în cavitatea alantoidiană de la cel puţin 4 ouă embrionate de găină puse la incubat timp de 8-10 zile. Ouăle inoculate sunt incubate la temperatura de 37°C şi se efectuează zilnic mirajul. Pe măsă ce embrionii mor, ouăle conţinând embrioni morţi sau muribunzi, precum şi toate ouăle rămase după 6 zile de la inoculare vor fi refrigerate la temperatura de 4°C şi vor face obiectul unor depistări ale hemaglutininei, plecându-se de la lichidul alantoidian/amniotic. Ideal ar fi ca aceste ouă să provină de la un efectiv liber de germeni specifici patogeni, dar, dacă nu este posibil, este admisă utilizarea ouălor provenite de la un efectiv recunoscut liber de anticorpi contra influenţei aviare.
Pregătirea ouălor și condițiile de incubare
Ouăle embrionate de găină trebuie alese cu grijă pentru a asigura un mediu favorabil propagării virusului. Se desemnează un set de cel puţin patru ouă embrionate, puse la incubat pentru a realiza un vector de cultivare eficient. Administrarea inoculului se realizează în cavitatea alantoidiană, unde mediul de creştere poate facilita producerea şi multiplicarea virusurilor introduse.
Condiții de sterilitate și control al contaminării
Ideal ar fi ca ouăle să provină de la un efectiv liber de germeni specifici patogeni; în caz contrar, se poate utiliza un efectiv liber de anticorpi contra influenţei aviare. Se implementează practici de control pentru a minimiza contaminatele exogene, asigurând compatibilitatea materialului biologic cu scopul experimențial. Mirajul zilnic permite monitorizarea stării embrionilor și detectarea eventualelor schimbări în dezvoltarea acestora.
Monitorizarea embrionilor și finalizarea experimentului
Pe măsură ce embrionii mor, ouăle cu embrioni morţi sau muribunzi se protejează prin izolarea acestora, iar după 6 zile de la inoculare toate ouăle rămase vor fi refrigerate la 4°C. Ulterior, ouăle sunt supuse depistărilor de hemaglutinină, folosind lichidul alantoidian/amniotic drept material de probă pentru detectarea virusurilor.
Potentiale rezultate și interpretarea lor
- Prezenţa hemaglutininei indică posibila replicare virală în ou sau în lichidele asociate.
- Absenţa hemaglutininei poate confirma o lipsă a replicării sau o inhibare a virusului în condiţiile de cultivare.
- Schimbările în morfologia embrionilor sau moartea prematură a acestora pot semnala efecte toxice sau inviabilitatea culturii.
Consideraţii etice și siguranţă în utilizarea ouălor embrionate
Gestionarea materialului biologic implică standarde riguroase de siguranţă şi etică, asigurând minimizearea riscurilor de contaminare și protecția personalului implicat în manipulare. Alegerea ouălor dintr-un efectiv liber de germeni sau anticorpi contribuie la reducerea variabilităţii rezultate din intervenţia virală.
Care sunt etapele procedurii de Fertilizare In Vitro și cât durează aceasta?
tags: #cultivarea #virusurilor #in #oua #embrionate #de