Proiectul vizează implementarea, la nivel de laborator și unitate pilot, a unei abordări integrate pentru producția de formule vaccinale inovatoare, menite să sporească capacitatea de răspuns rapid la provocările de sănătate publică. Soluțiile propuse se concentrează pe obținerea de antigene proteice prin tehnologia ADN recombinant, utilizând atât sisteme procariote (tulpini E. coli), cât și sisteme eucariote (linii celulare HEK293, celule de insecte) ca platforme de sinteză. Proteinele obținute sunt ulterior condiționate sub formă de ansambluri nanoparticulate, fie prin utilizarea unor „triggeri” de auto-asamblare, fie prin sisteme de adjuvanți de tip „oil-in-water”. Întregul proces va fi supus unui mecanism de optimizare continuă, adresându-se fiecărei etape specifice.
Contextul dezvoltării vaccinurilor și justificarea abordării propuse
Dezvoltarea vaccinurilor reprezintă o prioritate globală pentru combaterea afecțiunilor cauzate de agenții infecțioși, vaccinarea fiind considerată cea mai eficientă soluție. Tradițional, vaccinurile sunt produse prin tehnologii bazate pe patogeni inactivați sau atenuați, care necesită propagare pe culturi celulare sau ouă embrionate. În ultimii ani, pandemia cauzată de SARS-CoV-2 a stimulat dezvoltarea de noi tehnologii, cele mai de succes abordări fiind cele care au permis producție rapidă, precum vaccinurile bazate pe ARN mesager. Deși sistemul ARN mesager și „carrier”-ul lipidic este teoretic adaptabil la orice secvență de antigen, dezvoltarea acestor vaccinuri este costisitoare și necesită optimizări intensive.
Investițiile enorme necesare pentru vaccinurile anti-SARS-CoV-2, deși accesibile marilor consorți farmaceutice private, sunt prohibitive pentru instituțiile de sănătate publică. În plus, aceste vaccinuri au generat reticență publică, asociată cu măsurile restrictive impuse în pandemie. Prin urmare, capacitatea globală de dezvoltare rapidă de vaccinuri pentru uz uman la costuri reduse nu este o noutate, ci mai degrabă o raritate. Infecțiile respiratorii virale precum SARS-CoV-2, RSV și gripa pot crea dezastre la nivel mondial, cu complicații și mortalitate semnificative.
Abordări vaccinale pentru SARS-CoV-2 și alte virusuri respiratorii
Vaccinurile SARS-CoV-2 sunt investigare în numeroase studii clinice, cu accent pe obținerea unor titluri ridicate de anticorpi neutralizanți anti-proteina S. Multiple vaccinuri bazate pe proteina S sau pe domeniul de legare la receptor (RBD) sunt în studii clinice, inclusiv proteine S trimerice recombinante, domenii RBD monomerice sau trimerice, livrate prin vectori virali sau ARNm. Date recente sugerează că vaccinurile pe bază de proteine recombinante ar putea completa vaccinurile pe bază de acizi nucleici sau cu vectori virali, fiind evaluate în diverse alianțe adjuvante.
RSV este principala cauză de infecții de tract respirator inferior la sugari, vârstnici și adulți imunodeprimați, iar pentru RSV nu există încă un vaccin autorizat. Dezvoltarea vaccinurilor anti-RSV a întâmpinat dificultăți, inclusiv cazul vaccinului inactivat cu formol, care a condus la răspunsuri imunologice nedorite. Există interes crescut pentru vaccinuri subunitare sigure, vizând proteina de fuziune F, a cărei forma pre-fuziune stimulează în mod optim anticorpi neutralizanți.
Gripa reprezintă o amenințare anuală, iar eforturile sunt orientate spre un vaccin universal, prin combinarea antigenelor conservate și epitopilor care induc protecție încrucișată mediată de anticorpi și de limfocite T. În studiile despre vaccinuri pe ou embrionat, apar discrepante legate de adaptarea virusului pe ouă, afectând situsuri antigenice dominante.
Inovația în producția de biofarmaceutice și filosofia „outside the box”
Inovația în producția de biofarmaceutice este adesea monopolizată de corporații mari, iar în situații de criză, statul poate asigura protecția cetățenilor prin alternative de producție. Abordarea „Outside the Box” propune explorarea soluțiilor în zone mai puțin populare, cum ar fi proteinele recombinante produse în sisteme procariote, oferind o viață utilă și costuri reduse în producția de antigene cu potențial vaccinal.
Pentru a explora o zonă și mai puțin populară, proiectul își propune sinteza de proteine recombinante în sistem procariot, utilizând literatura științifică despre aplicațiile proteinelor produse în E. coli. Odată cunoscut genomul patogenului, secvența de nucleotide poate fi sintetizată în laborator pentru proteina de interes.
Procesul de sinteză a proteinelor recombinante în E. coli
Sinteza proteinelor recombinante se realizează prin tehnici de inginerie genetică, precum Overlap Extension PCR (OE-PCR), utilizând primeri cu capete complementare. Secvența nucleotidică poate fi optimizată prin utilizarea codonilor specifici sistemului de expresie. După obținerea secvenței, aceasta poate fi inserată într-un vector plasmidial cu promoter promotator (ex. T7), o secvență de selecție și o origine de replicare.
Plasmidul este introdus în tulpini E. coli prin transformare sau electroporare. În condiții optime, producția de proteină durează 3-5 ore și poate genera sute de miligrame de proteină per litru. Cu o doză de vaccin gripal tradițional de aproximativ 15 μg, teoretic se pot genera peste 10.000 de doze pe litru, cu costuri minime.
Pentru îmbunătățirea randamentului, se pot optimiza culturile bacteriene, condițiile de exprimare, purificarea și reducerea impurităților precum LPS. Proteinele pot fi fuzionate cu elastin-like polypeptides (ELP) pentru a facilita formarea de nanoparticule autoasamblabile, ale căror tranziții de fază generează structuri nanometrice.
Optimizarea expresiei, purificării și formelor de prezentare
Designul ADN-ului în silico presupune optimizarea codonilor, folosirea linkerelor, inserarea situsurilor de restricție și creare de proteine de fuziune pentru a promova nanostructurarea. Tehnici clasice precum PCR și variațiuni de tip Heterostagger-PCR sunt utilizate pentru generarea secvențelor complete. Construirea vectorilor implică alegerea celor mai potriviți plasmide în funcție de sistemul de expresie (procariot sau eucariot).
Expresia proteică poate implica tulpini E. coli optimizate și linii celulare mamale sau insecte pentru expresie eucariotă, cu teste în diferite medii de cultură. Parametrii de cultură vor fi corelați cu markeri transcriptomici pentru a crește randamentul. Extracția și purificarea se bazează pe metode precum cromatografia de afinitate, SEC și schimb ionic, cu îndepărtarea impurităților LPS prin tehnici adecvate. Refoldarea poate fi necesară pentru unele proteine, în funcție de condițiile de expresie.
Formularea antigenelor și adjuvantarea
Antigenele purificate sunt adesea slab imunogene, motiv pentru care alegerea adjuvanților și a sistemelor de livrare este crucială pentru creșterea imunogenității. Pentru nanoparticulele autoasamblabile, se utilizează sistemul bazat pe ELP; se explorează, de asemenea, cuplarea cu feritină sau mutații care promovează multimerizarea pentru a spori autoasamblarea.
Evaluarea imunogenității candidaților vaccinali implică inițierea răspunsului imun prin activarea celulelor dendritice (DC) și migrerea lor în organele limfoide pentru activarea limfocitelor T CD4+. Citokinele secretate dirijează diferențierea în subseturi Th1/Th2, influențând răspunsul umoral și celular. Se vor evalua în modele in vitro cocultură DC-limfocite T, iar ulterior imunizarea la animale va arăta polarizarea răspunsului adaptativ.
Exemple de vaccinuri și platforme conexe
Efluelda este un vaccin antigripal destinat persoanelor peste 60 de ani, cu protecție împotriva celor trei tulpini și o eficacitate observată la aproximativ 2-3 săptămâni după administrare. Vaccinarea anuală este recomandată datorită modificării tulpinilor virale și duratei protecției.
Vaccinul împotriva rujeolei este viu atenuat, destinat copiilor începând cu 12 luni, cu posibilitatea în anumite condiții de începere mai devreme. Administrarea se poate face intramuscular sau subcutanat.
ROMPORPOX este destinat imunizării active a porumbeilor împotriva variolei aviare, administrat prin badijonarea pielii deplumate, fără reacții generale postvaccinale.
ROKOVAC NEO este un vaccin veterinar pentru porcine împotriva rotavirozei și colibacilozei, cu componente adăugate de uleiuri minerale; riscuri de edeme sau necroză pot apărea în cazul injectării accidentale.
Vaccinul pentru boala Marek este destinat imunizării ouălor embrionate de 18 zile din cadrul unei colectivități specifice.
Rezultate așteptate și impactul local
Rezultatele principale preconizate constau în preparate vaccinale cu eficiență dovedită la nivel de studiu pe model de animal de laborator, a căror producție este fezabilă la nivel de unitate pilot. Ca rezultat secundar, se va dezvolta un pipeline bicomponent pentru producția de antigene cu potențial vaccinal și asamblarea acestora sub formă de nanostructuri, cu sau fără adjuvant. Acest livrabil poate oferi flexibilitate și reacție rapidă la urgențe medicale la nivel regional.
Abordarea „Outside the Box” poate oferi alternative viabile în absența unor posibilități de producție mari, promovând sinteza de proteine recombinante în E. coli și integrarea ulterioară în formulări imunogene.
Expresia proteinelor recombinante în Ecoli
Posibile tabele și date din proiect
| Componenta | Rol | Stadiu |
|---|---|---|
| Antigen proteic recombinat | Sinteză în E. coli sau linii eucariote | pilot |
| Nanostructuri autoasamblabile | Transport și livrare ale antigenelor | pilot |
| Adjuvanți oil-in-water | Potențarea răspunsului imun | pilot |
| Elastin-like polypeptides (ELP) | Element de formulare și purificare | laborator |
tags: #preparat #vaccinal #pe #oua #embrionate